PRP kullanımında optimize klinik sonuçların elde edilebilmesi için belli standartlar olmalıdır.

Bunların anlatımına geçilmeden önce plateletler hakkında kısa hatırlatma.

Plateletler

Plateletler kan hücreleridir ve kemik iliğinde pluripotent kök hücreleri olan megakaryosit olarak tanımlanan hücrelerin sitoplazmik parçalanması ile yapılmaktadır.

Ortalama yaşam süreleri 8-10 gündür ve her gün kemik iliğinden ortalam 100 milyar yeni platelet yapılmakta.

Erişkin bir insanda kan dolaşımında 1 trilyon platelet bulunmaktadır. Her bir litre kanda 150–400 X109 platelet bulunmaktadır.

Primer fonksiyonları kanamanın durdurulması ve pıhtının oluşumunun sağlanmasıdır. Sekonder olarakta yeni kan damarları ve doku oluşumunu sağlayarak; yara iyileşmesini düzenlemektedir.

Plateletler 2–3 mikron kadar küçük, çekirdeği olmayan, disk şeklinde üzerinde birkaç dikensi çıkıntılatıları olan  kan kan hücreleridir. Aktif olduklarında bu çıkıntılar uzamakta ve sayıları artmaktadır.

Plateletler 30 dan fazla biyolojik olarak aktif protein içermektedir. Bu proteinler platelet hücre içerisinde granüllerde yer almakta. Bunlar platelet aktif olduğunda hücre dışına salınmaktadır. Plateletlerin aktivasyonundan 10 dakika sonra bunların salındıklarını görmekteyiz. Salınanların % 95 i daha yapılmış olan aktif proteinlerdir. 1 saat içerisinde yenileri yapılmaktadır. 

Bu proteinler ile fonksiyonlarını yapmaktadır. Bu proteinler içerisinde 7 tanesi yara iyileşmesinde görev almaktadır. Bunlara platelet doku ve hücre büyüme faktörleri denilmektedir. 

Bunlar plateletlerden degranülasyon ile ortama salgılanan proteinlerdir. Bunlar bulundukları dokuda bulunan mesenşimal kök hücreleri, osteoblastlar, fibroblastlar, endotel hücreleri ve deri epidermal hücrelerin membranlarındaki reseptörlere bağlanmakta. Bu hücrelerde hücresel çoğalma, hücreler arası destek dokusu olan matriksin yapılanması, kollajen sentezini sağlayarak doku onarım ve yenilenmesini uyarmaktadır.

PRP elde edilmesi sırasında kanda hücrelerinin birbirine bağlanmasını sağlayan 3 adet proteinde bulunmaktadır; fibrin, fibronectin ve vitronectin.

Elde Edilen PRP de Platelet Sayısı

PRP elde edilmesi sırasında elde edilen trombosit sayısı son derece önemlidir. 

Yapılan çalışmalarda etkin bir PRP uygulaması için 5 ml PRP de 10 lakh/ml platelet olması gerektiği ifade edilmektedir.

Endotel hücrelerinde plateletlerin .oğalmayı stimüle edebilmeleri için platelet sayısı 1 ml de 1.25 × 106 olması gerekir ikenç yeni kan damarlarının oluşması-anjiyogenezis için 1 ml de 1.5 × 106 platelet olmalıdırö

Özetle PRP tedavi amaçlı kullanılacak ise 1 ml PRP de minimum 1 milyon platelet olmalıdır. 

PRP Formları ve İçerikleri

PRP yani plateletden zengnleştirilmiş plasma kandan elde edilmekte. Bu elde edilme yöntemi sırasında hücre içeriği ve fibrin yapısına bağlı olarak 4 farklı tanımlama yapılmakta.

1. Pure Platelet-Rich Plasma (P-PRP) yada lökositten fakir PRP; bunda lökosit ve fibrin dansitisitesi düşüktür.

2. Leucocyte PRP (L-PRP); bunda lökosit ve platelet var ve fibrin düşük oranda.

3. Pure platelet-rich fibrin (P-PRF); bunda platelet ve fibrin var ancak lökosit düşük. Bunlar fibrinden dolayı jel formunda ve enjeksiyonları daha zor.

4. Leucocyte-platelet-rich fibrin (L-PRF); bunda platelet ve lökosit var ce fibrin dansiyesi yüksek. 

PRP de hastadan uygulama sırasında kan alınarak bu kandan bir miktar PRP elde edilmekte. Örneğin 30 ml tam kandan 3-5 ml PRP elde edilebilmekte.

PRP tam kanın santrifüj ile ayrıştırılması ile elde edilmekte.

PRP elde edilmesinde 2 farklı yöntem kullanılmakta.

1. PRP metod; tam kan antikoagülan acid citrate dextrose -ACD içeren tüplere alınmakta. Düşük santrifüje alınmakta. Platelet ve plasma laınarak başka bir tüpte hızlı santrifüje edilmekte. Sonoçta altta PRP üstte PPP elde edilmekte. PPP alınır ve geriye kalan PRP hafif çalkalanır.

2. Buffy-coat metod; bu metotda tam kan santrifüz için 20-24 C beletilmelidir. Yüksek santridüjden geçirilir. Altta eritrosit bunun üzerinde lökosit ve platelten oluşan buffy coat ve bunnunda üzerinde pazma oluşmakta. Buffy coat alınmakta. Düşük santrifüjden geçirilmekte yada lökosit filtreleri kullanılarak platelet elde edilmekte. 

Günümüzde en fazla kullanılmaya başlanan yöntem PRP metodudur. Bu yöntemde tam kan 1. santrifüj işlemine alınmakta. Bu santrifüj ile tam kandan kırmızı kan hücreleri(RBC) ayrılmakta, tüpün altında kalmakta. Bunun hemen üstünde lökosit ve plateletlerin oluşturduğu buffy coat oluşmakta. Bunun üzerindede plateletden fakir plasma-PPP yer almakta. Üstte kalan olasma ve buffy cloat kısımı alınarak 2. santrifüj yapılmakta ve plateletler elde edilmekte.

PRP elde edilme yöntemlerinde elde edilen trombosit konsatrasyonuna göre sistemler 2 ye ayrılmakta.

  • Düşük platelet konsantrasyonu(normalin 2.5-3 katı fazla olanlar)
  • Yüksek platelet konsantrasyonu(normalin 5-9 katı fazla olanlar) olmak üzere.

Son yıllarda PRP elde edilmesinde yeni standartlar elde edimeye çalışılmakta. Bu çalışmalar PRP metodunun daha etkin olduğunu göstermekte.

PRP metodunda PRP de platelet konsatrasyonunu; santrifüj standartları(santrafüj hızı ve süresi), ortam ısısı, PRP hazırlanma standartları(kanın alınması, tüpler vb) ve antikoagülan kullanımı belirlemektedir.

Burada amaç en fazla platelet elde edilmesi yani en yüksek tam kanda plasma, WBC ve eritrositlerin plateletlerden ayrıştırılmasıdır. Burada alınan kan örnek miktarı(volüm), alınma şekli, santrifüj dönme hızı, santrifüj süresi ve santrifüj hızlanması gibi parametreler devreye girmekte.

Kanın alınma Standartları

22 gauge dan büyük iğneler kullanılmalı ve kan hızlı alınmalı. Bunun için en çok önerilen yöntem aşağıdaki gibi tek kullanımlık büyük iğneler ile vakumlu tüplere kan alma sistemlerdir.

Santrafüj Standartları

Kan plasma sıvısı ve içerisinde lökosit, eritrost platelet gibi farklı boyutlarda hücre içeren yapılar dünyanın yer çekimi ile birbirinden ayrılmakta. Alınan tam kan antikoagülanlı tüpte bekletildiğinde süre uzun olmakla birlikte plasma ve hücresel yapı(hemotokrit) birbirinden ayrılmaktadır. Ancak bu uzun süre içerisinde hücre içeriklerindeki aktif içerikler kaybedilmekte. Bu nedenle kanın hızla ayrışmasına yani santrifüje ihtiyaç duyulmakta. Santrifüj gücü yer çekiminden yüzlerce kat falza bir güçle kanın  ayrışmasını sağlamakta. Santrifüjün dönme hızı ile oluşan g kuvveti kanın ayrışmasını sağlamakta. g kuvveti RCF olarakta kısaltılmakta. Bu santrifüjde tüpün merkezinde 1 cm2 de oluşan kuvveti temsil etmekte ve yerçekim kuvvetine, santrifüj sistemindeki tüplerin merkeze olan uzaklığına ve santrifüjün dönme hızına(dakika dönme hızı; rpm) bağlıdır.

PRP de kullanılan santrifüj sistemlerinin temeli aynı olmakla birlikte fiziksel yapıları farklıdır. Belli bir standartları yok. Tüplerin dönme açısı, tüplerin santrifüj merkezine olan uzaklığı gibi. 

Yukardaki resimde görüldüğü horozontal santrifüjlerde tüpün merkezinde g daha fazla oluşmaktadır. Bu nedenle sabit açılı santrifüjlerde horozontal santrifüjlere göre aynı rpm de 2/3 daha fazla süreye ihtiyaç duyulmaktadır. Tüp horozontal duruyor ise tüpte santrifiüj ile daha fazla g elde edilecektir. Eğer sabit açılı ise ve 45 açısı var ise g 2/3 oranında düşmekte. Bu nedenle süre 45 derceik tüplerde 1.5 katı olmalıdır.

PRP de kullanılan santrifüj süre ve hızları ya g-RCF yada rpm olarak ifade edilmekte. Daha sıklıkla rpm kullanılmakta. Satrifüj g olarak verilmiş ise o zaman aşağıdaki formül ile kendi santrifüjümüzdeki g karşılık gelen rpm bulmalıyız.

Formül

Tüpün merkezinde cm 2 de g-RCF = 0.00001118 X r (tüp merkezinin santrifüj dönme merkezine olan uzaklığı) X (rpm) 2

Buna göre 3 cm r si olan sabit açılı bir santrifüjde 100 g 1726 rpm karşılık gelmekte.

PRP hazırlanan ortamın ısısı

Ortam ısısı platelet aktvasyonu için önemlidir.

American Association of Blood Banks-AABB ye göre PRP ortam ısısının 21°C-24°C olması önerilmekte.

Bazı çalışmalar ısının platelet aktivasyonu olmaması için 12°C-16°C kadar düşük olması gerektiğini ifade etmekte.

PRP Hazırlanmasında Ankoagülan kullanımı

Antikoagülan olarak EDTA kullanılmamalıdır. Bu platelet hücre membranını hasarlandırmakta.

Önerilen sitrat ve sodyum sitarat dekstroz kullanımıdır. ACD-A pH 4.9 ve sitart iyon konsantrasyonu 15.6 mg/mL dur. Bu özellikleri ile ideal antikoagülandır.

Tam kan ACD-A li tüpe alındığında iyice 5-10 kez ters düz edilerek karıştırılır.  

Her 10ml tam kana 1.5 ml ACD-A kullanılmalı.

PRP de uygulama öncesi plateletlerin aktivasyonu

Bu en fazla tartışılan konu. PRP hazırlanmasında uygulama öncesi platelet aktivasyonu için dışarıdan trombin, kalsiyum klorid yada mekanik travma kullanılmaktadır. Platelet aktive olduğunda fibrin network oluşmakta. Buda PRP jel formuna çevirmekte. Aktifleştirilmiş PRP enjekte edilemez.

Dokularda bulunan kollajen plateletlerin doğal aktivatörüdür. Bu nedenle platelet aktivasyonuna aslında gerek yoktur.

Örnek bir PRP hazırlanması

3.5 mL tam kan alınıdı. 100×g 10 dakika 1. santrifüj işlemine alındı. 

Üstteki plasma alanı steril ikinci tüpe alındı ve 400×g 10 dakika 2. santrifüj işlemine alındı. İkinci santrifüj önemli çünkü eritrositlerin ve lökositlerin bazıları halen ilk santrifüjden sonrada bulunmakta. İkinci santrifüjde tüpün en altında eritrositler üzerinde lökosit ve plateletler yer almakta.

Üstte kalan 2/3 kırım alınır bu artık normalin 5 katı (%70-80 daha fazla) kadar yüksek platelet içeren PRPö

Santrifüj cihazının tüp merkezi ile santrifüj merkezi arasındaki mesafesi yani r 3 cm iseÇ

100×g 3 cm radiusta 1726 RPM e, 400×g 3453 RPM karşılık gelmekte.

Eğer santrifüz horozontal ise süre yine 10 dakika. ancak sabit açılı ise süreyi 2/3 oranında arttırmak gerekmektedir. 12-14 dakika gibi.

Birkaç diğer örnekler;

1. santrifüjde 900g; 5180 RPM 5 dakika

2. santrifüj 1000g; 5460 RPM 10 dakka  optimize değer olarak sunulmakta.

Diğer bir öneri 1. santrifüjde 100 g; 1726 RPM 5 dakika, 2. santrifüj 400 g 3453 RPM 10 dakika

Döndürme süresi 8 dakikadan uzun olduğunda ve santrifüj 2,324 g'den daha büyük olduğu durumlarda PRP de trombosit knsantrasyonu daha optimize olmakta.

1. santrifüjde maksimum platelet ve en düşük lökosit isteniyor ise santrafüj 800 g den büyük olması gerekmekte. Santrifüj 800 g'dan daha büyük olduğunda lökosit miktarı neredeyse sıfıra düştüğü gösterilmiştir.

1. santrifüjde eğer lökosit ve trombosit geri kazanımı yüksek isteniyor ise santrafüj 1,000g den düşük olmalıdır.

Daha fazla detay isteyenler için!

PRP hazırlanmasında Deneysel santrifüj ve Tüp modelleri

Santrifüjde tam kanın ayrılmasını açıklamak için çok fazlı akış fenomeni olarak tanımlanan temel bir fizik kuramına dayanan sistematik bir analizden önemli ölçüde faydalanılabilir.

Kanı plasma ve farklı boyutlarda hücrelerden(trombositler, lökositler ve eritrositler) oluşan sıvı ve parçacıklardan oluşan sürekli ve dağınık fazlar olarak düşünebiliriz. Bir ortamda bulunan tek bir küresel parçacığın çökelme hızını tanımlayan Stokes yasası bunu açıklamak için kullanılabilir.

  • Bu matematiksel bir modele çevrilebilmektedir. Burada modeli etkileyen parametreler;
  • Hücre süspansiyonunun geri akışının etkisi modeli
  • Parçacık-parçacık etkileşimleri
  • Sınırlı tüp geometrisi ve
  • Başlangıçtaki tam kan hacmi gibi sıralanabilir.

Böylece bir tüpte bulunan tam kanı horozontal santrifüj ederek hazırlanan PRP'deki platelet ve lökosit geri kazanım oranlarını tahmin etmek için yeni bir teorik model gelişirilmekte. Geliştirilen modelin fiziksel arka planını netleştirmek için, kinematik dalga teorisini, her bir fazın; yani plasma, platelet ve lökositlerin hacim fraksiyonlarını, santrifüjleme süresi, hızlanma, tüp geometrisi ve başlangıç durumunun bir fonksiyonu uygulanır. 

 

Yukardaki resimde sabit bir kesit alanına sahip dönen bir tüpte parçacıkların santrifüjle tüp içerisindeki dağılımının tanımı yapılmıştır. Santrifüjde belirli bir süre sonra parçacıkların konsantrasyon bölgeleri oluşmakta. Tüpte en üstte parçacık bulunmayan berrak bir sıvı (α  = 0), çökelme bölgesi (0 < α < αmax) ve tam çökelme bölgesi (alt tabaka) (α = αmax) oluşmakta.

Burada tüpte katı fazın hacim fraksiyonu kanda eritroist, paltelet ve lökosit gibi hücresel partiküllerin(αmax) maksimum konsantrasyonudur.

L; Tüpte kanın toplam yükseliğidir. Aslında tüpe konan tam kan miktarıdır .

D tüpün çapı

R0 santrifüj merkezi ile tüpün tabanı arasındaki mesafe

l n-s ; santrifüj merkezi ile berrak sıvı-çökelme bölgesi sınır mesafesini

l s-d santrifüj merkezi ile çökelme bölgesi-tam çökelme sınır mesafesini göstermekte.

Burada eritroistleri, lökositleri ve plateletleri tekdüze küre şeklinde küresel küresel parçacıklar (sırasıyla deritrosit, dlökosit ve dplatelet) ve yoğunluğu (sırasıyla ρeritrosit, ρlökosit ve ppletelet) ve plazma sıvı fazı (yoğunluk, ρplas) olarak kabul ederiz.

Düz tüp içindeki eritrosit ve lökositlerin konsantrasyonları yukarıdaki resimde α ile tanımlanmıştır. Grafikte santrifüj süresi saniye olarak tc ile gösterilmekte. Grafikte santrifüj tüp yarı çapı r ile gösterilmekte. Grafikte 1,000g santrifüjde tc sürelerine bağlı α değişimleri görülmekte.

Mavi kesik çizgiler üstteki lökosite alttaki eritrosite ait. Buna göre A alanında minumum lökosit ve maksimum RBC için tc 6-7 dakika görülmekte.

9 ml tam tüpünde en iyi sonuçlar için tc 10 dakikada 900 g gibi olmalıdır. 

Mesela 1000 g de ve tc 10 dakikada yüksek platelet ve düşük lökosit elde edilirken, 300 g de ve 10 dakikada yüksek platelet ve yüksek lökosit elde edilmekte. 

Santrifüjde rpm g nasıl hesaplanacak

Bu siteden kendi santrifüjünüzdeki rpm ve g hasaplamasını yapabilirsiniz. 

http://www.endmemo.com/bio/grpm.php 

Eğer yukarıda anlatılan formül karmaşık geliyor ise vasit bir rpm bulma yöntemi ise aşağıda gösterilmektedir.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

.

 

 

 


Sorunuzu Gönderin
dermatoloji randevu
dermatoloji doktor cevapliyor
Adres: Bulgurlu Mahallesi Libadiye Caddesi No:15 Daire:9 Üsküdar/İstanbul
GSM: 0532 624 21 27
Bu sitedeki bilgiler doktor ya da eczacıya danışmanın yerine geçmez. Sitedeki bilgi, yorum ve görüntüler kişileri bilgilendirme amaçlı olup, tanı ve tedaviye yönlendirme amaçlı değildir.
© 2017 Hakan Buzoğlu. All Rights Reserved.
ByFlash Web Agency